HPLC使用操作和注意事项

HPLC使用操作和注意事项

HPLC流程简图：

流程

流程：如右图所示，溶剂贮器（1）中的流动相被泵（2）吸入，经〔3〕梯度控制器按一写的梯度进行混后然后输出，经（4）测其压力和流量，导入（5进样阀（器）经（6）保护柱、（7）分离柱后到（8）检测器检测，由（10）数据处理设备处理数据或（11）记录仪记录色谱图，（12）馏分收集器收集馏分，（13）为废液。.

1. 操作步骤

1. 排空状态：将吸液头让在已经超声的甲醇中，旋松排空阀让机器以高流速排走机器或输液管的气泡，3—5分钟后关闭排空阀，排空结束。

2. 冲洗状态：以适当流速冲洗机器核色谱柱大约20分钟;同时开启检测器，让检测器处于预热和自检状态。

3. 联机状态：打开联机电脑让色谱工作站和HPLC机器相连设定吸收波长，适当流速，查看系统压力是否正常。

4. 用已经配好的流动相换下甲醇开始走基线，此过程大约20分钟

5. 当基线平稳，开始进样准备。

6. 进样前用进样液清洗六通阀2-3次。

7. 样品打入机器开始谱图。

8. 谱图完成清洗机器和关闭电脑：用甲醇做流动相以适当流速开始冲洗机器大约15分钟，确定甲醇已经充满机器管道。同时用甲醇清洗六通阀若干次。退出色谱工作站和关闭电脑。

9. 整理数据填写结果。

2. 注意事项

1、进样前样品处理及注意事项
（1）须用专用平头液相专用注射器进样（禁用气相尖头进样针）；
（2）进样试液应无颗粒、浑浊和乳化，使用前先用超声波溶解后，须用0.45um 的过滤膜过滤；
（3）部分装取样时，取样体积一般小于定管的50%，完全装液相取样体积取必须是定量环的5 倍以上

2、操作中注意事项：

1)． 流动相均需色谱纯度，水用20M的去离子水。脱气后的流动相要小心振动尽量不引起气泡。

2)  柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要让液体过柱子。

3） 所有过柱子的液体均需严格的过滤。

4)   压力不能太大，最好不要超过150kgf/cm2 .

5)  因为缓冲试剂遇有机溶剂，会结晶，有损色谱柱，所以，每次由有机相变流动相或流动相变有机相均需用蒸馏水清洗。

6） 温度是影响HPLC的压力重要原因之一，所以尽量保持恒温。